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PCR实用技巧:七大方法消除引物二聚体

| 2019-07-14 阅读 129


相信很多人一听到引物二聚体的时候都会很愤怒,因为几乎我们每个人都受到过它的折磨。它作为 PCR 的副产物,甚至有时候是主要产物充斥着我们的整个 PCR 实验过程。你在被它折磨的不行不行的时候,你有想过它为什么总是出现在你的实验结果中吗?


接下来就让我带大家走进它的世界,了解它,认识它,最后战胜它。


01

引物二聚体是什么鬼?

引物二聚体其实就是一对引物或者引物自身的 3’ 端部分碱基互补结合,在 Taq 酶的作用下从 3’ 末端延伸所形成的小分子量的双链 DNA 片段。

图示:

02

引物二聚体是如何形成的?

  • 最根本的原因是引物之间或者引物自身 3’ 端部分碱基互补结合

  • 模板量过低

  • 引物浓度过大

  • 引物长度过短

  • 退火温度低

  • 循环次数过高

  • 03

    如何区分引物二聚体和目的条带?

    因为引物二聚体的大小从几十 bp 至几百 bp 不等,所以当你的目的条带的分子量比较小的时候,电泳后所看到的结果不一定是目的条带,很有可能是引物二聚体,所以我们需要一个有效的方法来区分二者。当我们对引物二聚体形成的本质了解了之后,想要区分二者其实并不难,我相信大家看到这里的时候已经知道了引物二聚体形成的本质了,但是我还要强调一遍:引物二聚体形成的本质其实就是引物之间或者引物自身的 3’ 端区域存在部分互补结合。


    也就是说,引物的形成是不需要模板的参与的,所以我们只需要在电泳的时候添加一组对照就可以有效的判断是否有引物二聚体的形成,以及如果有引物二聚体的形成,它的分子量是多大,从而区分开引物二聚体和目的产物。

    这个对照就是:模板用 H2O 替代,其他的都一样。这样的话,如果这个泳道有条带出现,那说明形成了引物二聚体(当然前提就是该体系没有被模板污染)。从这里也可以看出设置对照的重要性,一个巧妙的对照往往可以达到事半功倍的效果。

    04

    如何消除引物二聚体?

  • 重新设计引物,这是解决该问题最根本的办法

  • 增加模板用量

  • 减小引物浓度

  • 引物长度适中

  • 提高退火温度

  • 减少循环次数

  • 可以适当的在 Mix 中添加少量的甘油或 DMSO

  • 最后,希望大家在读了该篇文章后,引物二聚体可以永远离你而去!


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